微囊藻毒素分析試劑盒說明書
（時間分辨熒光免疫法）
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：微囊藻毒素分析試劑盒（時間分辨熒光免疫法）
【包裝規(guī)格】
96測試/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于水中、藻樣或水產(chǎn)品中微囊藻毒素的定量檢測。
- 水樣的處理：將采集的水樣離心取上清或過濾后的濾水直接測定。
- 藻樣的處理：采集的藻樣可以三種方法處理：a. 反復(fù)凍融（3-5次）；b. 超聲破碎；c. 細(xì)胞壓榨機破碎。
- 水產(chǎn)品的處理：方法較復(fù)雜，可參考文獻方法：Valéria Freitas de Magalh?es, Raquel Moraes Soares, Sandra M.F.O. Azevedo. Toxicon, 2001, 39:1077
【檢驗原理】
時間分辨熒光免疫分析（Time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）是目前標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)中靈敏度和穩(wěn)定性較高的新一代免疫學(xué)檢測技術(shù)。其利用具有獨特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物,代替酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等來標(biāo)記抗體或抗原，待抗原或抗體反應(yīng)發(fā)生后，用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強度。本TRFIA試劑盒的技術(shù)原理是樣品中的微囊藻毒素與微囊藻毒素-BSA銪標(biāo)記物競爭結(jié)合抗微囊藻毒素單克隆抗體。檢測過程中，先加入單抗到測試孔中，測試孔中已包被有羊抗鼠lgG，用于捕獲加入的鼠抗微囊藻毒素單抗，接著加入含有微囊藻毒素的樣品及微囊藻毒素-BSA銪標(biāo)記物，銪標(biāo)記物與樣品中的微囊藻毒素競爭結(jié)合同樣的抗體結(jié)合點。孵育后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的分子，加入增強液，銪在增強液作用下從復(fù)合物上解離后發(fā)出強的熒光。
由于各個孔中抗體可結(jié)合位點是相同的，并且加入的微囊藻毒素銪標(biāo)記物的量也是相同的，樣品中微囊藻毒素含量低的則銪標(biāo)記物結(jié)合得多，檢測熒光值高。反之，樣品中微囊藻毒素含量高的則銪標(biāo)記物結(jié)合得少，檢測熒光值低。熒光值與微囊藻毒素的含量成反比。本試劑盒的檢測示意圖如下：
【主要組成成份】
| 組份名稱 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 主要成分 |
| MCLR標(biāo)準(zhǔn)品 | 0.5 mL/瓶 | 6 | A 0ng/mlL B 0.1ng/mL C 0.3ng/mL D 1.0ng/mL E 2.0ng/mL F 4.0ng/mL |
| MCLR銪標(biāo)記物 | 0.5 mL/瓶 | 1 | Eu-BSA-MCLR，BSA、Tris-HCl，防腐劑 |
| MCLR反應(yīng)板 | 96孔/塊 | 1 | 鼠二抗，微孔板 |
| MCLR分析緩沖液 | 30 mL/瓶 | 1 | Tris-HCl、NaCl，BSA等 |
| MCLR單抗 | 6 mL/瓶 | 1 | MCLR單抗、NaCl，BSA等 |
| 增強液 | 50 mL/瓶 | 1 | β-NTA、TOPO等 |
| 濃縮洗液25× | 40 mL/瓶 | 1 | Tris-HCl、NaCl、Tween-20等 |
| 封片 | 張 | 3 | / |
| 說明書 | 份 | 1 | / |
| 純化水 | 10.0 mL/瓶 | 1 | / |
【自備的設(shè)備和試劑】
時間分辨熒光免疫分析儀；
100 mL量筒或其他適用容器；
振蕩器；
洗板機；
不同量程的移液器；
蒸餾水或去離子水；
其他適用企業(yè)校準(zhǔn)品。
【儲存條件及有效期】
- 本試劑盒于2~8℃儲存，有效期12個月。開封后，儲存于2~8℃，試劑盒有效期為4周。
- 請將不用的微孔板放進原錫箔袋中，并且與提供的干燥劑一起重新密封。
- 試劑盒生產(chǎn)日期和失效日期見產(chǎn)品標(biāo)簽。
【適用儀器】
1. 廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司DR6606或DR6626時間分辨熒光免疫分析儀。
2. 可適用鑭系時間分辨熒光免疫分析檢測的其他儀器。
【檢驗方法】
- 試劑的準(zhǔn)備
（1）洗滌液：將40 mL濃縮洗液和1000 mL純化水混合（1:25倍稀釋），作為工作洗滌液。
（2）MCLR銪標(biāo)記物：用分析緩沖液以1:20倍稀釋作為銪標(biāo)記物工作液，一次配制一次試驗所需用量。
- 將所需數(shù)量的包被反應(yīng)條置室溫平衡。
- 每孔50 μL?MCLR標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，50 μL?MCLR銪標(biāo)物，50 μL?MCLR單抗，按順序加入微孔反應(yīng)條小孔中，并加貼封片，室溫振動孵育45分鐘。
- 用洗滌液沖洗6次，拍干。
- 每孔加入增強液150?μL，室溫振蕩孵育5分鐘。
- 測定熒光值，激發(fā)光為340nm，發(fā)射光為615nm。
【計算方法】
可采用以下兩種方法進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，計算樣品中的微囊藻毒素濃度：
1、半對數(shù)擬合法
測值之后計算標(biāo)準(zhǔn)品平均熒光值，A點即0ng/ml的熒光值為Bmax，計算出標(biāo)準(zhǔn)品B至F點（0.1，0.3，1.0，2.0和4.0ng/mL）的結(jié)合率B（B標(biāo)準(zhǔn)品/Bmax），以B（B標(biāo)準(zhǔn)品/Bmax）作為Y軸，微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)濃度的對數(shù)值為X軸（InMC），繪制曲線，獲得線性擬合方程。通過每個樣品的結(jié)合率（B樣品/Bmax），根據(jù)擬合方程計算出樣品中的微囊藻毒素濃度。
2、logit-log擬合法
Logit-log是免疫學(xué)檢測中的用于競爭法的經(jīng)典模型。與半對數(shù)擬合法類似，測值之后計算標(biāo)準(zhǔn)品平均熒光值，A點即0ng/ml的熒光值為Bmax，并計算出標(biāo)準(zhǔn)品B至F點（0.1，0.3，1.0，2.0和4.0ng/mL）的結(jié)合率B（B標(biāo)準(zhǔn)品/Bmax），縱坐標(biāo)為，微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)濃度的對數(shù)值為X軸（InMC）, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得線性擬合方程。通過每個樣品的結(jié)合率B（B樣品/Bmax），根據(jù)擬合方程計算出樣品中的微囊藻毒素濃度。
在用上述兩種方法計算樣品中的微囊藻毒素濃度時，如果樣品結(jié)合率B（B標(biāo)準(zhǔn)品/Bmax）在設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合率范圍之內(nèi)，就可以得出一個具體的濃度值。如果樣品結(jié)合率超出了范圍則說明樣品的濃度大于高濃度的標(biāo)準(zhǔn)（本試劑盒中為4ng/ml）或低于低濃度的標(biāo)準(zhǔn)（本試劑盒中為0.1ng/ml），高濃度樣品需稀釋后重測，低濃度樣品則需富集后重測。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
- 劑量反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)r2值應(yīng) ≥?0.99；
- 精密性：本試劑盒檢測的變異系數(shù)（CV）應(yīng) ≤?15.0%。
【注意事項】
1. 請嚴(yán)格按照說明書操作。
2. 不同批號的試劑盒不要混用；本試劑盒各組分只能一次性使用，不能重復(fù)使用。
3. 整個實驗過程應(yīng)盡量在干凈無塵的環(huán)境下進行。
4. 本試劑盒與待檢樣本使用前必須平衡至室溫。
5. 為了避免樣本中任何潛在的生物危險，檢測樣本應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，避免接觸到皮膚和粘膜。
6. 洗板機在每天使用時應(yīng)進行校正注液量和殘留量，注意管道是否通暢。洗滌時，確認(rèn)每孔中的洗滌液都注滿微孔。每次洗滌后都需在無塵吸水紙上拍干微孔中的液滴。
7. 使用干凈的一次性容器配制銪標(biāo)記物，應(yīng)避免銪標(biāo)記稀釋液進入銪標(biāo)記物原液中。
8. 加增強液時，吸頭應(yīng)懸空，避免因吸頭碰到小孔邊緣或其中試劑而造成增強液污染。
9. 本試劑盒中所有試劑應(yīng)置于2~8℃冰箱保存，自生產(chǎn)日期起有效期為一年。開啟后請盡量避免反復(fù)使用，板條若未能一次用完，剩余板條用塑料袋封口后密封保存。