Microcystin Plate Kit

一、基本原理

酶聯(lián)免疫(ELISA)是免疫酶技術的一種，是將抗原抗體反應的特異性與酶反應的敏感性相結(jié)合而建立的一種新技術 ELISA 的技術原理是:將酶分子與抗體(或抗原)結(jié)合，形成穩(wěn)定的酶標抗體(或抗原)結(jié)合物，當酶標抗體(或抗原)與固相載體上的相應抗原(或抗體)結(jié)合時，即可在底物溶液參與下，產(chǎn)生肉眼可見的顏色反應，顏色的深淺與抗原或抗體的量成比例關系，使用ELISA檢測儀，即酶標儀，測定其吸收值可做出定量分析。此技術具有特異、敏感、結(jié)果判斷客觀、簡便和安全等優(yōu)點，日益受到重視，不僅在微生物學中應用廣，而且也被其他學科領域廣為采用。本試劑盒工作原理如下圖所示。

二、已配試劑

ELISA 試劑盒中配備以下條目:

1、96 孔已包被好的酶標板

2、標準 1:0.1 ng/mL 的 MC-LR 標準溶液

3、標準 2:0.2 ng/mL 的 MC-LR 標準溶液

4、標準 3:0.5 ng/mL 的 MC-LR 標準溶液

5、標準 4:1ng/mL 的 MC-LR 標準溶液

6、標準 5:2ng/mL 的 MC-LR 標準溶液

7、1瓶溶液1(單抗)

8、1只溶液2(此溶液僅為二抗稀釋所用，并非二抗溶液，請按稀釋比例量取!)

9、二抗(小管內(nèi)含 2.4 μL酶標二抗，4℃保存)。

10、1瓶溶液3(底物溶液)

11、1瓶溶液4(終止液)

12、1袋固體PBS(配置洗滌液用)

13、1只Tween20(配置洗滌液用)

三、需配器材及試劑

除試劑盒內(nèi)的物品外，還需配備以下器材和試劑:

1、酶標儀(若可能，可配有洗板機)

2、微量移液器(100mL)(若可能，可配8道或12道微量移液器)

3、吸管、橡皮吸頭(洗板時用，若有洗板機，無需準備此項)

4、純水(用于配置洗滌液)

5、玻璃瓶(盛裝洗滌液)

6、記時器(準確控制每步操作時間)

7、封口膜(防止孔內(nèi)液體揮發(fā))

四、酶標二抗的配置

將小管二抗用溶液2按1:5000稀釋，充分溶解混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配

五、洗滌液的配置

將固體PBS以純水配置成1L溶液(pH7.4-7.6)，從塑料小管取出0.5 mI

Tween 20 于前配置的PBS溶液中。室溫保存。

六、樣品的預處理

1、藻樣的處理:采集的藻樣可以三種方法處理:a.凍融(2-3次);b.超聲破碎

c.細胞壓榨機破碎。

2、水樣的處理:將采集的水樣離心取上清或過濾。

3、水產(chǎn)品的處理:方法較復雜，可參考文獻方法:Valéria Freitas de Magalhǎes,

Raquel Moraes Soares, Sandra M.F.O.Azevedo. Toxicon, 2001,39:1077

七、操作步驟

1、分別吸取50μL毒素標準品或樣品與對應的孔中(參照表 1),然后吸取50μL

單克隆抗體(溶液1)加入每孔中，輕輕混勻。37°℃或室溫放置90分鐘。

注意:必須先加標準品或樣品，再加單克隆抗體溶液。

2、洗板

在水池邊快速甩出酶標板中的液體。用吸管吸取洗滌液，加入板孔中，洗滌液量以加滿但不溢出板孔為宜。甩出洗滌液，再加洗滌液，重復上述操作三次，每次操作3分鐘。在濾紙上拍干。若有洗板機，可直接在洗板機上操作。

注意:切忌溢出互混!

3、每孔加入100mL酶標二抗稀釋液，37℃或室溫放置30分鐘。

4、洗板

同2方法，此步驟必須洗滌五次，每次3分鐘。

5、加底物溶液 3

立即用排槍或吸管吸取此種溶液，分別加于板孔中，每孔100μL，置37℃或室溫顯色，經(jīng)常觀察，顯色時間不超過30分鐘。

6、終止反應

有明顯顏色顯示后，立即加50μL溶液4 1mol/L H2SO4終止反應。

7、判斷結(jié)果

肉眼觀察(白色背景)，陰性對照孔應明顯黃色。

測光密度，酶標儀取λ=450nm。注意:加終止液后，30分鐘以內(nèi)檢測。

注意:滴加試劑量要準，且試劑不可從一孔流到另一孔中，每種試劑對應一種吸管(或槍頭)，不能混淆。

八、數(shù)據(jù)處理

1、酶標板中對應孔加樣情況:

C1、C2、C3、C4、C5:毒素標準;? S1~S42:被檢測樣品

2.計算每個標準或樣品的平均OD450值，并按以下公式算出B0.

3.根據(jù)標準樣品的B0值與對應濃度對數(shù)值之間的關系做出標準曲線,下圖標準曲

線可以作為參考。

4.根據(jù)標準曲線計算每個樣品的濃度。

本試劑盒的研制獲得國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)“藍藻毒素分析技術體系及現(xiàn)場快速測試技術”(編號:2001AA641030)、“藍藻毒素現(xiàn)場快速測試技術與產(chǎn)業(yè)化”(編號:2003AA641020)等項目的支持。