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作者：廈門大學 李峰

在微藻培養(yǎng)過程中，需要了解微藻細胞的生長情況和速率，這個時候最常用的方法就是生長曲線繪制，這個時候用血球計數板是最常用的計數方法。本文作者提供利用血球計數板計算藻細胞密度數量的操作步驟和常見問題。

利用血球計數板計數方法

一、血球計數版計數所需的儀器和試劑

圖1血球計數版計數所需的儀器和試劑

二、魯格試劑的配制

即將6克碘化鉀溶于20ml水中，待其完全溶解后，加入4克碘充分搖動，待碘全部溶解后定容到100ml即配成魯哥氏液。（用棕色玻璃瓶裝）。

固定濃度：每1000毫升水樣加入10-15毫升魯哥氏液。

三、血球計數版的基本構造：

1、基本結構

血球計數版用優(yōu)質厚玻璃制成。每塊計數 板由H形凹槽分為2個同樣的計數池。計數池兩側各有一支持柱，將特制的專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0.1mm的計數池，如圖所示：

?????????????????????????圖2 血球計數版結構示意圖

2、計數區(qū)

計數區(qū)的刻度：計數區(qū)分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。計數區(qū)邊長為1mm，則計數區(qū)的面積為lmm²，每個小方格的面積為1/400mm²。蓋上蓋玻片后，計數區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數區(qū)的體積為0.1mm³，每個小方格的體積為1/4000mm³，如圖所示：

圖3 計數區(qū)示意圖,紅色區(qū)域為16個1/400的小方格組成

四、計數步驟

（1）準備待測藻液（如果濃度過高，進行稀釋），用Lugol’s solution固定。?

（2）取潔凈的血球計數板一塊，在計數區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。

（3）用移液器吸取少許藻液（20μl），從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（如圖4）。

圖4 加樣示意圖

（4）靜置片刻，使細胞沉降到計數板上，不再隨液體漂移。將血球計數板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數區(qū)后，再轉換高倍鏡觀察并計數。

（5）在圖5中區(qū)域（25個中格選5個區(qū)域）進行計數。

（6）每個樣品重復2-3次。

（7）計算。

??????計算公式為：

五、注意事項

為了保證計數的準確性，避免重復計數和漏記，在計數時，對沉降在格線上的細胞的統計應有統一的規(guī)定。如藻細胞位于大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞不計入本格。見圖6：

六、使用技巧

血球計數板在使用中可以用到如下技巧：

1. 為了計數視野清晰，其實可以往水里加點染料，或者加個濾光片，顯微鏡下看反差會大些，用投射光源不要反射光
2. 一般計數的取樣在幾微升，要用移液槍
3. 細胞計數板在使用一段時間后，顯微鏡下看不清格子，記得每次使用完用稀鹽酸或者酒精清洗。